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Projets de recherche subventionnés en 2006

Rôle de l'inactivation de l'X dans l'expression de l'hémophilie A chez la femme

1ière année de subvention
Wenda L. Greer, PhD
Dalhousie University, Halifax, Nouvelle Écosse

L'hémophilie A est un trouble héréditaire récessif de la coagulation lié à l'X qui résulte de mutations affectant le gène du facteur VIII (FVIII). La maladie s'exprime en général chez les hommes qui n’ont qu'un seul chromosome X, transmis par la mère. Les femmes obtiennent quant à elles un chromosome X de chaque parent. Les femmes qui n'héritent que d'un seul gène du FVIII muté n'expriment généralement pas la maladie. Les rares exemples d'hémophilie A à se manifester chez les femmes hétérozygotes sont habituellement causés par une anomalie de l'inactivation du chromosome X. Cette anomalie entraîne l'inactivation d'un des deux X de toutes les cellules de la femme très tôt au cours de son développement. L’inactivation de l’X est un phénomène normal qui compense le fait que les femmes ont deux fois plus de chromatine X que les hommes. Chez la plupart des femmes, environ la moitié des cellules inactivent l'X maternel et la moitié, l'X paternel. Dans de rares cas, c’est le phénomène d'inactivation de l’X qui est déréglé. Si le dérèglement favorise l'expression d’un chromosome X muté, une femme hétérozygote peut être affectée par une maladie récessive liée à l'X.

Dans une famille, on a dénombré plusieurs cas d'hémophilie A chez des hommes, mais aussi chez des femmes. L'analyse du cas d'une de ces femmes a montré que la plupart de ses cellules exprimaient le chromosome X paternel muté. Selon notre hypothèse, les femmes hémophiles de cette famille expriment l'hémophilie A en raison d'un mode non aléatoire d'inactivation de l'X. Il est peu probable que cette anomalie exceptionnelle de l'inactivation de l’X, observée chez trois femmes d’une même famille, soit due au hasard. Nous avons donc supposé que ces femmes sont héréditairement prédisposées à une inactivation anormale de l’X.

L'inactivation de l’X est contrôlé en cis par un ARN non traduit, encodé par le gène Xist. Le gène Xist est régi par l'ARN Tsix qui est antisens par rapport au gène Xist. Selon des études effectuées chez des souris, un élément de contrôle du chromosome X règle à la baisse l'expression du gène Tsix et modifie la probabilité d'inactivation du chromosome X.

Notre objectif est d’arriver à expliquer pourquoi les femmes de cette famille expriment l'hémophilie A. Notre hypothèse est que leurs chromosomes X renfermant le gène du FVIII normal a été sélectivement inactivé, laissant ainsi au gène du FVIII muté la possibilité de s'exprimer. Plus spécifiquement, nous nous proposons de vérifier l'hypothèse selon laquelle une région du chromosome X renferme un élément contrôleur du chromosome qui influe sur la sélection de l’X et cause la maladie dans cette famille.

Plus spécifiquement nos buts sont :

  1. D’utiliser des marqueurs-microsatellites polymorphes à 5 cm d'intervalle pour comparer les chromosomes X des sœurs de cette famille, affectées et non affectées, qui présentent respectivement un mode anormal et aléatoire d'inactivation de l'X. Nous supposons que les régions où ils diffèrent définiraient la région critique où se trouve l'élément de contrôle potentiel.
  2. De compléter la comparaison de ces chromosomes X à l'aide de microdosages de type CGH (hybridation génomique comparative) pour chercher les dédoublements, les élisions et la méthylation différentielle (en collaboration avec le Dr Wam Lam de Toronto).
  3. De développer un modèle systématique de cultures cellulaires pour étudier le processus d'inactivation du chromosome X chez la femme. Avec ce système testable, nous déterminerons si l'inactivation de l'X se trouve sous contrôle génétique. Nous disposerons ainsi d'un outil pour localiser le gène porteur de l'élément de contrôle de l'X.

Non seulement cette étude fournira-t-elle des réponses à cette famille, mais elle nous éclairera aussi sur les fondements biologiques de l'inactivation du chromosome X.

Différences génétiques entre les porteurs obligatoires de la MVW de type 3 et les sujets atteints de la MVW de type 1

2ième année de subvention
Dr. Paula James
Queen’s University, Kingston, Ontario
Program de la SCH

La maladie de von Willebrand est le trouble héréditaire de la coagulation le plus répandu chez l’être humain, puisqu’elle affecte jusqu’à 1 % de la population. Les personnes qui en sont atteintes ont des problèmes d’hémorragies des muqueuses, notamment celles du nez, de la bouche, de la paroi interne de l’utérus; les personnes atteintes peuvent aussi manifester des saignements anormaux après avoir subi une blessure accidentelle, ou une intervention dentaires ou chirurgicale. Il existe trois sous-types de maladie de von Willebrand : le type 1 est le plus fréquent et le moins sévère; il est dû à un déficit de léger à modéré en facteur de von Willebrand, un facteur de la coagulation, aussi désigné par l’abréviation vWF. La maladie de von Willebrand de type 3 est la plus rare et la plus sévère; elle est due à un déficit plus marqué en vWF. Pour sa part, la maladie de von Willebrand de type 2 est causée par une dysfonction du vWF.

La maladie de von Willebrand de type 1 est transmise par un parent, tandis que la maladie de von Willebrand de type 3 est transmise par les deux parents. Dans le cadre de cette étude, intitulée Genetic Differences Between Obligate Carriers of Type 3 VWD and Individuals with Type 1 VWD (Différences génétiques entre les porteurs obligatoires de la maladie de von Willebrand de type 3 et les sujets atteints de la maladie de von Willebrand de type 1), nous souhaitons nous pencher sur les modifications génétiques propres à la maladie de von Willebrand. Une personne affectée par la maladie de von Willebrand de type 1, en aurait hérité d’un parent, tandis qu’une personne affectée par la maladie de von Willebrand de type 3, en aurait obligatoirement hérité de ses deux parents. En général, le parent d’un individu souffrant de la maladie de von Willebrand de type 3 VWD ne souffre pas de problèmes hémorragiques et est considéré « porteur » Au moyen de techniques spéciales qui nous permettent d’étudier le bagage génétique d’une personne, nous espérons approfondir notre compréhension des types de changements génétiques qui pourraient conduire une personne à être atteinte de la maladie de von Willebrand de type 1 et une autre à être porteuse de la maladie de von Willebrand de type 3.

Microcapsules implantables pour la thérapie génique de l’hémophilie A

1iére année de subvention
Dr. Gonzalo Hortelano
McMaster University, Hamilton, Ontario

Nous souhaitons étudier la faisabilité d'une technique de transplantation cellulaire pour corriger l'hémophilie A sévère chez des souris. Bien que les produits de facteur VIII (FVIII) actuels soient sécuritaires, les patients doivent toute leur vie s’administrer régulièrement des perfusions de FVIII et un traitement tout aussi sécuritaire, plus économique et moins fastidieux est souhaitable.

La thérapie génique est une solution de rechange, les stratégies de ce type utilisent des virus comme véhicules pour introduire le gène du FVIII, mais elles sont associées à des réactions immunitaires indésirables. Il est également possible de recourir à des cellules transplantées qui fabriquent le FVIII, mais dont le fonctionnement n'est que temporaire. Nous proposons la transplantation de cellules non autologues (ne provenant pas du patient) obtenues par génie génétique qui fabriqueraient le FVIII de manière continue. Pour prévenir leur rejet, on insère les cellules transplantées dans des microcapsules (de moins de 1 mm de diamètre) avant de les transplanter. Ces microcapsules permettent la libre circulation du FVIII, mais elles sont à l’épreuve des cellules immunitaires, ce qui protège les cellules qu’elles renferment.

Nous avons découvert que les souris à qui on avait transplanté des microcapsules renfermant des cellules musculaires conçues par génie génétique pour sécréter du facteur IX (FIX), maintenaient des taux élevés de FIX dans le sang pendant au moins 120 jours sans déclencher de réactions immunitaires à l'endroit du facteur IX. Plus important encore, chez des souris atteintes d'hémophilie B sévère, ce traitement a permis de corriger la maladie. S’il était possible d'obtenir les mêmes résultats chez l'être humain, cela éliminerait pour ainsi dire l'hémophilie sévère et modérée. C’est dans ce but que nous entendons appliquer la même stratégie à l'hémophilie A.

Pour débuter, nous créerons des cellules musculaires capables de fabriquer du FVIII et nous déterminerons quelle quantité de FVIII elles peuvent sécréter. Ensuite, nous incorporerons les cellules productrices de FVIII dans des microcapsules qui seront transplantées à des souris afin de calculer la quantité de FVIII qui circule dans le sang et pendant combien de temps. Toute réponse immunitaire élaborée contre le FVIII sera étudiée. En dernier lieu, la correction de la maladie chez des souris atteintes d'hémophilie A sera analysée.

Le traitement par transplantation pourrait réduire, voire éliminer, le recours aux perfusions régulières de FVIII. À noter, les microcapsules peuvent être retirées, ce qui augmente l'innocuité du traitement.